Od chvíle, kedy sa Peter Parker (Tobey Maguire) rozhodol opustiť svoju dlhoročnú lásku Mary Jane Watson (Kirsten Dunst), aby sa mohol v kostýme Spider-Mana aj naďalej zodpovedne venovať svojmu povolaniu superhrdinu, ušli dva roky. Jeho túžba po milovanej M.J. sa ale postupom času stala ešte silnejšia a to je dôvod, aby sa tajného života superhrdinu na dôkaz svojej lásky vzdal. M.J. sa však medzitým rozhodla ísť ďalej, dala sa na dráhu filmovej herečky a v jej živote figuruje nový muž. Peter má problémy i so svojim najlepším priateľom Harrym Osbornom (James Franco). Ich priateľský vzťah začína byť stále viac zahaľovaný Harryho závisťou voči Spider-Manovi, Ktorého viní zo smrti svojho otca. Keď už sa zdá, že sa situácia nemôže zmeniť k horšiemu, Peter je postavený tvárou tvár mocnému Dr. Octopusovi (Alfred Molina) - diabolskému stvoreniu s dvomi pármi smrtiacich chápadiel, ktoré sú mu viac ako dôstojným protivníkom. Aby dokázal jeho výčiny zastaviť, musí sa naučiť žiť so svojím osudom a využiť všetky svoje schopnosti, ktoré sú mu zároveň darom i prekliatím.